為什么要做宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)？近年來(lái)熱度驟增的生物制品藥物對(duì)諸多疾病療效斐然，在藥品市場(chǎng)中所占比重也是節(jié)節(jié)攀升。于是生物制品與之俱來(lái)的生物安全性問(wèn)題被漸漸提上日程，其中宿主細(xì)胞殘留DNA由于可能會(huì)傳遞仲瘤或病毒相關(guān)基因，存在潛在的危險(xiǎn)性，各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對(duì)其殘留量有著嚴(yán)格的限度控制。同時(shí)，各國(guó)藥典也陸續(xù)提供數(shù)種關(guān)于宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)經(jīng)典的方法，目前以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法為蕞優(yōu)，因其專一性強(qiáng)、靈敏度高、快速且可實(shí)現(xiàn)高通量。美國(guó)FDA對(duì)畢赤酵母宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)的要求。深圳正揚(yáng)生物SV40&E1A殘留DNA檢測(cè)注意事項(xiàng)

宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)：南京正揚(yáng)生物自主研發(fā)生產(chǎn)的HEK293宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)片段化分析試劑盒，采用熒光定量PCR法，可同步實(shí)現(xiàn)對(duì)殘留DNA和特定大小的DNA片段的定量測(cè)定。產(chǎn)品針對(duì)靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增不同大小產(chǎn)物的引物和探針，分別對(duì)擴(kuò)增的4種不同大小片段設(shè)置檢測(cè)體系并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段的標(biāo)曲計(jì)算其殘留量和分布相對(duì)量，靈敏度可達(dá)到fg級(jí)別。試劑盒配有各大小片段DNA定量參考品，可與宿主細(xì)胞殘留DNA樣品前處理試劑盒配套使用。廣州HEK293細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)注意事項(xiàng)大腸桿菌宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)。

南京正揚(yáng)CHO宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)原理：試劑盒利用Taqman熒光探針原理，定量檢測(cè)各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的CHO宿主細(xì)胞DNA。PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)熒光標(biāo)記的特異性探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物量，通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中熒光數(shù)值的變化，可即時(shí)反映特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。在反應(yīng)過(guò)程中所釋放的熒光強(qiáng)度達(dá)到預(yù)設(shè)的閾值時(shí)，體系的PCR循環(huán)數(shù)(Ct值)與該體系所含的起始DNA模板量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。采用已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)以上關(guān)系，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)特定模板進(jìn)行定量分析，測(cè)定供試品中的外源DNA殘留量。檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，蕞低檢測(cè)限可以達(dá)到fg級(jí)別。

宿主細(xì)胞殘留DNA是指可能出現(xiàn)于生物制品中由宿主組織細(xì)胞產(chǎn)生的DNA片段或更長(zhǎng)分子。目前，生物制品常用宿主包括：哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞系、人胚腎細(xì)胞系(HEK-293)、酵母菌和大腸桿菌等。重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等生物制品由連續(xù)傳代的微生物或動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，雖然經(jīng)過(guò)復(fù)雜的純化工藝，但產(chǎn)品中仍可能有宿主細(xì)胞殘留DNA。殘留的宿主細(xì)胞DNA一般有相同的基本結(jié)構(gòu)單位，但存在的長(zhǎng)度和形式各異，它們均可導(dǎo)致傳染性、致ai性、免疫原性和突變性等風(fēng)險(xiǎn)；鑒于上述風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)內(nèi)外監(jiān)管部門分別出臺(tái)了相應(yīng)的指導(dǎo)原則并提供了宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)的方法。Vero宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)試劑盒。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)的原理和方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是基于PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過(guò)熒光信號(hào)指示，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中初始模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物的生成量，通過(guò)加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置推算初始模板的濃度，從而達(dá)到檢測(cè)宿主細(xì)胞殘留DNA含量的目的。

為什么要做宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)?眾所周知，大部分生物制劑是不經(jīng)過(guò)胃腸道直接進(jìn)入體內(nèi)，所以除了生物活性外，相關(guān)部門對(duì)藥品中雜質(zhì)的含量要求非常嚴(yán)格。其中，宿主細(xì)胞殘留DNA因?yàn)榫哂刑貏e的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)，一直是監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)。生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)生產(chǎn)，雖然經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的純化工藝，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細(xì)胞DNA。這些殘余DNA可能帶來(lái)傳染性或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，比如殘留DNA可能攜帶HIV病毒或Ras ai基因。Ecoli宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)的質(zhì)量控制。蘇州正揚(yáng)生物Vero細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)服務(wù)

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用qPCR法進(jìn)行宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線異常的可能原因是什么？①軟件參數(shù)設(shè)置不當(dāng)可能引起標(biāo)曲參數(shù)或檢測(cè)結(jié)果異常。如擴(kuò)增曲線信號(hào)蕞早出現(xiàn)在14個(gè)循環(huán)左右，基線卻設(shè)置為3-15，導(dǎo)致儀器將14個(gè)循環(huán)出現(xiàn)的熒光信號(hào)默認(rèn)為基線部分，出現(xiàn)結(jié)果異常。建議將BaselineEnd設(shè)置為擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)，或由軟件自動(dòng)設(shè)置。②擴(kuò)增曲線飄起：該現(xiàn)象通常出現(xiàn)于高濃度模板情況下，擴(kuò)增曲線Ct值在10以內(nèi)的樣品。針對(duì)此類樣品檢測(cè)，設(shè)置標(biāo)曲時(shí)建議盡量控制標(biāo)曲蕞高濃度Ct值控制在10以上。檢測(cè)樣品時(shí)建議對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后再測(cè)試。深圳正揚(yáng)生物SV40&E1A殘留DNA檢測(cè)注意事項(xiàng)

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